特纳综合征有卵卵巢的生物预示指标及保存

　　不孕和身材矮小是特纳综合征(Turner’s syndrome,TS)患者的两个主要问题。近20年来，重组生长激素(Groeth Hormorn,GH)用于治疗发育不全，使大多数TS患者成年身高能达到或稍低于正常人群的下限。由于卵巢早衰是该病的一个典型症状,所以接受赠卵和保存剩余卵子成为治疗不孕的有效方法之一。

　　15-30％的TS患者具有自发青春期，但仅2-5％的有初潮者可能怀孕，表明TS患者的卵泡有雌激素分泌，但是过早消失，消失的动态过程目前尚未完全阐明。在早期研究中，对TS女孩进行卵巢皮质组织活检、冻存并分析卵泡，发现10例青春期女孩中8例有卵泡存在。目前,具有生育要求的年青女性肿瘤患者抗癌治疗前行卵巢皮质组织冻存已作为保存始基卵泡将来治疗不孕症的一种选择,目前移植冻融卵巢组织已获得健康后代。

　　本研究目的是通过TS患者的卵巢组织冻存，并与临床和激素方面包括年龄、核型、自发月经、青春期卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、颗粒细胞源性抗米勒管激素(AMH)水平进行综合评估预测患者生育能力。

　　临床资料

　　本研究包括57例TS患者，年龄8-19.8岁，由瑞典(主要是南部的斯德哥尔摩和斯科纳)25位儿科内分泌医师推荐，患者和其父母被告知研究详情，并签署知情同意书。我们详细告知患者及家属不能预测所获卵巢组织中是否有卵子用于将来治疗不孕症，同时告知组建家庭时的其它选择如卵子捐赠和领养,大多数家庭接受建议并加入研究。

　　在患者最多的医学中心仅有15人拒绝加入。我们认为有卵巢早衰迹象的患者也有可能发现卵泡，所以不拒绝任何患者的参与。本研究通过Karolinska研究所伦理委员会批准，并严格按照赫尔辛基宣言和瑞典医学研究伦理法律进行。

　　除去7个小于12岁的女孩，50个女孩中19个有自发青春期开始征象，13例(26％)出现月经初潮，21例正在行HRT。目前尚无研究证实能够发现卵泡的最小卵巢体积，所以没有在进行研究前行超声或核磁共振成像(MRI)检查。根据瑞典治疗规范，患者接受人生长激素(GH)、甲状腺素(T4)和雌激素替代治疗(HRT)。

　　淋巴细胞染色体分析确定TS诊断，28例为45X，7例嵌合体(45X/46XX/47XXX)，剩余22例为其中一条X染色体结构异常(SAs)，包括长臂或短臂缺失、异染色体、环状染色体或Y型片段。染色体分析结果由患者就诊的医学中心提供，分析细胞数由于检测时间、地点不同，介于15-105之间。

　　遗传实验室报告详细程度也有不同，少数报告甚至缺乏关于X染色体臂缺失或复制的详细信息。所有的染色体分析结果均来自淋巴细胞培养，也有一些对颊粘膜细胞或其它组织进行过荧光原位杂交分析(FISH)报告。

　　方法

　　腹腔镜

　　患者在全身麻醉下行腹腔镜活检获取卵巢组织供冻存。10个女孩因卵巢呈条状或太小而不能活检甚至难于识别。其余47例患者的一侧卵巢25-50％皮质组织进行了活检。

　　冻存

　　切除的卵巢组织立即置入含HEPES缓冲液及人血清白蛋白的体外受精培养液中。切下0.5-3mm3 卵巢皮质供组织学活检，剩余组织切成小的条带状，约0.5×3-5mm，与冷冻保护剂丙二醇蔗糖一起通过缓慢程序化冷冻。

　　组织学活检和卵泡计数

　　每例患者的新鲜卵巢组织切一小块固定在Bouin’s溶液中，石蜡包埋，切片，苏木素和伊红染色。采用数据成像分析系统连接倒置显微镜对活检标本的卵泡总数和卵泡密度进行评估。卵泡密度用分析样品中每立方毫米中的卵泡数表示，仅对正常卵泡进行计数。通常健康少女的卵泡密度大于500/mm3。

　　激素测定

　　28例检测FSH、LH、AMH的血样本在行腹腔镜活检前一天抽取，19例血样本在活检后一年内送检，剩余10例无血样本。

　　对47例患者进行了血清FSH、LH测定，43例在Karolinska研究所的女性健康研究实验室用固相双点化学发光免疫测定法(Immulite)进行检测。FSH的分析灵敏度为0.1mIU/ml，特异性很高，与人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促甲状腺激素(TSH)、LH、催乳素、人GH或人类胎盘生乳素(HPL)无可测到的交叉反应。

　　LH的分析灵敏度为0.1 mIU /ml，特异性也非常高，与hCG、FSH或TSH无可测到的交叉反应。剩余4例血FSH在Karolinsha大学附属医院临床化学中心实验室检测，该实验室根据WHO FSH和hCG生物学检测法第二届国际参比制剂(IRP)定标。FSH检测的灵敏度为0.7 mIU /ml，其临界水平广泛应用于欧洲，相应的浓度为17 IU/L，美国广泛应用标准是根据第二届IRP标准校正的。

　　在瑞典Karolinska研究所女性健康研究实验室对43个患儿血清进行AMH浓度测定，使用两步AMH酶联免疫试剂盒。采用厂商建议的超灵敏方案。此法对AMH检测有非常高的特异性，与TGF-β无交叉反应。灵敏度定义为显著区别于零标准的概率为95％的最低AMH浓度，为0.7pmol/L。

　　统计

　　诊断试验的敏感性和特异性分别用来计算阳性和阴性预测值。阳性预测值是指试验结果阳性时患者所占比例，反映试验的灵敏度。阴性预测值指试验结果阴性时非患者所占比例，反映试验的特异性。结果以ROC(接受者操作特性曲线)曲线表示，采用χ2检验进行统计学处理，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　结果

　　腹腔镜

　　所有57例腹腔镜均为日手术，即患者上午入院，下午或傍晚即可出院，本研究无麻醉或手术并发症。

　　LH，FSH和AMH

　　所有患者行活检时36例未予HRT， 21例给予HRT，考虑到hCG测量的假象未行激素测定。测定LH、FSH共30例，有17例血清LH和/或FSH值高于同龄正常水平，其中13例活检标本未发现卵泡，其余4例有卵泡;有13例激素值在同龄正常范围内，其中9例发现卵泡，4例无卵泡。

　　有卵卵巢

　　57例患者中有47例可以在一侧卵巢进行活检，其中15例(占总数26％)有卵泡，数目介于0.7-1200/mm3之间。7例嵌合体中6例(86％)可见卵泡，22例SAs中6例(27％)发现卵泡，28例核型为45X中3例(10.7％)有卵泡。19例具自发青春期特征的患者11例(58％)有卵泡存在，13例自发月经来潮者8例(62％)有卵泡。

　　大于12岁的30名无自发青春期特征的患者中，3例(10％)发现有卵泡。一名11岁女孩虽无明显青春期征象，却发现有卵泡存在。

　　预测卵泡存在的阳性预测值(敏感性)前五位指标为：核型为嵌合体(0.86)，FSH值11 mIU/ml(0.69)，AMH2 pmol/L(0.64)，自发月经来潮(0.62)，自发青春期始动(0.58)。

　　无卵泡的阴性预测值(特异性)分别为：核型45X(0.89)，AMH2 pmol/L(0.88)，无自发青春期始动(0.87)，小于12岁(0.82)，无自发初潮(0.81)，FSH值15mIU/ml(0.77)，年龄大于16岁(0.76)，核型为SAs(0.73)。以上6个因素中5个具统计学意义，其中年龄因素不显著，尽管最小年龄组的阴性预测值较高。

　　结论

　　本研究结果提示TS女孩卵巢能否发现卵泡的5个重要因素：核型、低FSH、高AMH、自发月经初潮以及自发性青春期。总之，以下几类TS女孩有卵泡的几率最高，可以考虑在13-17岁期间行腹腔镜活检卵巢组织冻存：1)嵌合体(45X/46XX/47XXX);2)有自发性青春期及45X或45X/46X+SAs;3)血清FSH和/或AMH正常伴或不伴自发性青春期。

　　假设用以上3条标准预测本研究患者，则有19例应在同一年龄段行腹腔镜手术，其中11例可发现卵泡，8例无卵泡，其敏感度为0.58(9/11)。15例年龄较小的患者，推迟腹腔镜手术意味着尚有2例仍可能在以后发现卵泡，因为这2例均有青春期特征。23例未行腹腔镜手术患者，按照第三条标准，2例有卵泡的可能被漏掉。排除无卵泡TS女孩的特异性应为0.91(21/23)。

　　讨论

　　大多数具有自发性青春期和嵌合体的TS患者可发现卵泡并不奇怪。令人意想不到的是3例无自发性青春期和4例高FSH、LH及低AMH患者亦有卵泡存在。卵巢内卵泡的闭锁及促性腺激素浓度增加的过程似乎发生在一个重叠时期，至少在某些个体是这样的。3例有卵泡者至少曾经有过卵巢功能，只是未表现出任何青春期征象，意味着她们的小卵泡不能分泌足够量的雌激素而促使青春期开始。

　　另一方面，2例患者血清促性腺激素正常且AMH>2pmol/liter却未见卵泡，可能她们用于组织学分析的小片标本中无卵泡，而冻存的卵巢组织或其它部分卵巢组织中存在卵泡，众所周知，卵泡在卵巢内的分布是不一致的。同样4例促性腺激素水平正常及4例AMH水平较高者也未见卵泡。

　　本研究行腹腔镜前不要求行超声或盆腔MRI检查证实有无卵巢。部分女孩已在当地医院行经腹超声探查，但结果和与腹腔镜所见的吻合率极低。

　　以往也有研究提示经腹超声结果是可靠的，与研究者的特殊兴趣、专业技能培训及良好的设备相关。临床常规中MRI检查可能是发现卵巢组织更好的方法，如按以上标准患者不适宜腹腔镜卵巢活检时，可选择MRI。研究中2例有卵泡因不符合以上标准而被遗漏者，或许可以通过MRI确诊。

　　TS女孩达13或14岁时有必要考虑是否行活检，尽管年龄和能否发现卵泡之间无统计学差异。大部分达到该年龄段的患者已能理解为将来保存卵巢组织的可能性与局限性，因储存细胞用于生育治疗的经验有限，所以有必要告知患者无法保证其将来一定能获得生物学子代。

　　由于TS患者妊娠可增加并发症风险，应和患者及其父母讨论并告知其妊娠需要产科专家的特殊观察。有心脏异常(主动脉瓣关闭不全或主动脉狭窄)或高血压的妇女发生致命性主动脉夹层动脉瘤的风险显著增加，但仍需进一步研究。

　　关于TS患者子代染色体异常风险是否增高的相关文献还很少，因此关于该风险的评估尚不可靠。 尽管已口头和书面详细告知TS患者其获得子代机会有限及未来妊娠的各种已知和未知风险，征集此类女孩参与研究还是很容易的，因为只要以后技术上有可能行生育治疗，患者似乎都愿意尽一切力量。从13-14岁起，这些患者自身即可开始积极的参与，而对于更年轻的女孩们，必须由其父母做最终决定。

　　冻存卵泡经体外受精成功后，条件允许时，所有TS妇女均应行胚胎植入前遗传学诊断(PGD)，孕期行绒毛膜取样或羊膜穿刺术子代核型检查。本研究经验使我们更加确信TS患者年轻时行卵巢活检并储存，在该组人群不孕症的治疗方面迈出了非常重要的一步。